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楊巍/郭江濤/楊帆課題組Cell Reports合作發文揭示TRPM2孔區選擇性濾器門控新機制

來源 :基(ji)礎醫學系    發布時間 :2021-11-17    瀏覽次數 :527

離子通道是細胞膜上一類含有親水性孔道的重要膜蛋白,它們通過離子跨膜轉運調控膜電位,是細胞電信號產生和傳導的基礎。離子通道因感受細胞內外特異的化學或物理信號刺激,如溫度、酸堿度、脂質微環境、機械力、滲透壓等,而開放或關閉其“閘門 (gate) ”的過程被稱為通道的“門控 (gating) ”。離子通道的門控調節對細胞信號轉導、細胞體積維持及細胞離子穩態調控起著關鍵作用。值得一提的是,今年諾貝爾生理學或醫學獎頒給了兩位從事離子通道科學家,表彰其發現溫度覺 (TRP channel) 和觸覺(Piezo channel) 感知的關鍵離子通道。

TRPM2通道隸屬于TRP超家族M亞家族,作為一種重要的體內氧化應激感受器,近年來研究表明其激活門控受到ADPR和Ca2+格調控,并發(fa)現其介導了包括腦卒中,糖尿病,神經退(tui)行疾(ji)病和炎癥反應等氧化應激(ji)相關疾(ji)病,被認為是上(shang)述疾(ji)病的(de)潛在治療靶標。然而,近(jin)年(nian)來滿(man)堂彩APP下載TRPM2通(tong)道門控機制(zhi)研究(jiu)雖有(you)了一定進展 (Wang et al., Science, 2018; Huang et al., eLife, 2019) 但人源TRPM2通道 (hsTRPM2)  孔區結構和門控調節機制仍不清楚。

2021年11月,滿堂彩楊巍、郭江濤和楊帆團隊Cell Reports雜志在線發(fa)表了研究(jiu)論文(wen)"Structural and Functional Basis of the Selectivity Filter as a Gate in Human TRPM2 Channel"。文章鑒定了人源TRPM2通(tong)道(dao)離(li)子選(xuan)擇性(xing)濾器(qi)分子結(jie)構,并(bing)發現其為通(tong)道(dao)離(li)子通(tong)透的(de)上端閘門 (gate),該研究(jiu)為闡明TRPM2通道(dao)的(de)門控機(ji)制以(yi)(yi)及(ji)以(yi)(yi)TRPM2通道(dao)為靶標的(de)藥(yao)物(wu)研發提供了新的(de)分子基礎。


該(gai)團隊研究人員首先借助冷凍電鏡解(jie)析首個nanodisc組裝下的(de)(de)近原(yuan)子(zi)分辨率結(jie)(jie)(jie)構(gou) (3.76Å) ,并解(jie)析了較為完(wan)整的(de)(de)孔(kong)區(qu)構(gou)象(xiang) (3.68Å) 。與已解(jie)析的(de)(de)hsTRPM2在去(qu)垢劑(detergent)結(jie)(jie)(jie)構(gou)相比,hsTRPM2通道nanodisc結(jie)(jie)(jie)構(gou)其胞內區(qu)沒有明顯差(cha)別,但跨膜區(qu)電壓敏(min)感樣結(jie)(jie)(jie)構(gou)域(Voltage sensoring-like domain, VSLD )和孔(kong)區(qu)結(jie)(jie)(jie)構(gou)域(pore region)則(ze)更加(jia)靠(kao)近通道孔(kong)區(qu)中心,各(ge)亞基之間距離更加(jia)緊(jin)密。

團隊研(yan)究人員進一步結合計算生物學發現其(qi)孔區選擇性濾(lv)器組成為“FGQI”基序,其(qi)最窄區域直徑小于1Å(Toth et al., PNAS, 2012),提(ti)示(shi)可(ke)能充當(dang)通(tong)道(dao)的上端閘門(men)(upper gate)。相(xiang)反,斑馬(ma)魚(Danio rerio)和海葵(Nematostella vectensis)兩個物種(zhong)的TRPM2通(tong)道(dao)結(jie)構(gou)顯示(shi)其選擇(ze)性濾(lv)器并(bing)非為閘門(men),提(ti)示(shi)TRPM2通(tong)道(dao)選擇(ze)性濾(lv)器的閘門(men)機(ji)制可(ke)能存在物種(zhong)差異(yi)。


圖1. 人源TRPM2孔區在nanodisc的電鏡結構

為了進一步驗證結構和計算預測,研究人員綜合利用點突變、膜片鉗電生理功能研究、基于銀離子修飾的半胱氨酸可及性分析(Substituted Cysteine Accessibility Method,SCAM)等多種研究手段,發現“FGQI”基序的突變會引起全細胞TRPM2通道電流明顯減弱。單通道記錄結果表明“FGQI”基序的突變會引起Ca2+外液下翻轉電位改變,對Ca2+與Na+通透率和單通道電導(Single channel conductance)也發生了改變。證(zheng)明“FGQI”基序(xu)確(que)實(shi)是TRPM2通道選擇性濾器(qi)。

為了進一步探究選擇性濾器是否形成閘門,研究人員引入SCAM,其原理是基于銀離子(Ag+)與半胱氨酸殘基(Cysteine)接觸會形成共價結合,進而觀察是否影響通道電流特征來判定。

有趣的是,hsTRPM2通道在關閉狀態下給予銀離子孵育并不影響其通道功能,而在hsTRPM2通道孔區引入半胱氨酸突變后,僅在通道開放時才會有Ag+通過,進而導致通道失活,證明該選擇性濾器確實作為通道閘門。而在低等動物海葵TRPM2 (nvTRPM2) 通道中,則發現其關閉態下即可允許Ag+通過,進而修飾引入的半胱氨酸,并導致通道激活速率變慢。上述結果表明TRPM2通道孔區選擇性濾器在低等動物中并未形成閘門,而進化至高等動物比如人中則進化為通道閘門,首次揭示了TRPM2通道選擇性濾器存在進化過程的物種(zhong)差異(yi)性。

該研究不僅(jin)有助于解析TRPM2通道(dao)復(fu)雜的(de)門(men)控(kong)調節機制(zhi),加(jia)深對TRPM2通道(dao)介導的(de)重要生理病理進程的(de)理解,也為(wei)以TRPM2通道(dao)為(wei)靶點(dian)的(de)藥物(wu)研發提供新的(de)分子基礎。


圖(tu)2. 人源(yuan)TRPM2(左圖)與海葵TRPM2 (右圖) 選擇性濾器閘門機制探究



3. 人源TRPM2 (hTRPM2) 和海葵TRPM2 (nvTRPM2) 的選擇性濾器門控分子機制與功能在物種間的差異性示意圖。(卡通右圖:鹿琳博士)

該研究得到國家自然科學基金重(zhong)(zhong)點和(he)面上項(xiang)目、國家(jia)新藥(yao)創新重(zhong)(zhong)大專(zhuan)項(xiang)和(he)浙江省自然科學杰出青年(nian)基金等項(xiang)目的資助。楊巍(wei)課題(ti)組夏飛博(bo)士、郭江濤課題組(zu)博(bo)博(bo)士后解媛(yuan)博士、中(zhong)國科滿堂彩官網深(shen)圳先進技(ji)術研究院/深(shen)圳理工(gong)大學(xue)張小康研究(jiu)員和滿(man)堂彩(cai)醫滿(man)堂彩(cai)官(guan)網蛋白(bai)質平(ping)臺(tai)馬騁博士為共同(tong)第一作者(zhe),楊巍教授、郭江濤研(yan)究(jiu)員和楊帆研究員為共同(tong)通訊作者。特別感謝聶焱副教授(上海(hai)科技大學(xue))、張(zhang)巖研究員(滿堂(tang)(tang)(tang)彩)、張(zhang)興教授(滿堂(tang)(tang)(tang)彩)、羅建紅教授(滿堂(tang)(tang)(tang)彩)、江林華博士(英國利茲大學)、常勝海博士(滿堂彩)和黃麗(西湖大學)對本工作的支持,也感謝滿堂彩和南方科技大學冷凍電鏡中心,滿堂彩醫滿堂彩官網公共技術平臺對本工作支持。


參考文獻
[1] Tóth, B., and Csanády, L. (2012). Pore collapse underlies irreversible inactivation of TRPM2 cation channel currents. PNAS 109,13440-13445.
[2] Wang, L., Fu, T.M., Zhou, Y., Xia, S., Greka, A., and Wu, H. (2018). Structures and gating mechanism of human TRPM2. Science. 362:eaav4809–35.
[3] Huang, Y., Roth, B., Lü, W., and Du, J. (2019). Ligand recognition and gating mechanism through three ligand-binding sites of human TRPM2 channel. eLife. 8:e36409.